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Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd
Ultratiefe Phosphorylationsproteomik für die selektive Bewertung von Proteinkinase-Inhibitoren
Datum:2025-08-26Lesen Sie:0
Proteinphosphorylation ist eine weit verbreitete Form der post-translationalen Modifikation der Eukaryozellen und spielt eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung, den Zellprozessen und der Regulierung der Proteinfunktion. Proteinphosphorylation ist die Übertragung der Endphosphatgruppe Adenosin-Triphosphat (ATP) über eine Proteinkinase auf Serin, Surin und Tyrosinreste des Substratproteins. Genmutationen oder abnorme Expressionen von Proteinkinasen verursachen eine überaktive Kinase, die Krebs und andere Erkrankungen auslöst. Daher ist Proteinkinase zu einem der wichtigsten Ziele von Antitumormedikamenten geworden. Derzeit sind weltweit mehr als 80 Genehmigungen für Kinase-Inhibitoren (PKIs) verfügbar und rund 180 weitere PKIs laufen in klinischen Studien. Trotzdem stehen die Forschung und Entwicklung von PKI-Medikamenten vor vielen Herausforderungen, insbesondere bei der Zielselektivität und der Off-Target-Toxizität. Derzeit ist die selektive Bewertung von PKI hauptsächlich abhängig von Hunderten von Klonen gereinigter Proteinkinasen oder Zelllinien mit genetisch veränderten hohen Ausdruck von Zielkinasen. Die gereinigte Kinase kann aufgrund der Trennung von der zellulären Umgebung die Selektivität von PKI in der Zelle nicht wirklich widerspiegeln; Der Test von genetisch veränderten Zellen beschränkt sich auf vorgegebene Zielkinasen. Als Antwort auf diese Frage hat die Fachgruppe Kangqianwu im Nationalen Schlüssellabor für die Regulierung kleiner Moleküle des Lebensprozesses des Instituts für organische Chemie der chinesischen Akademie der Wissenschaften in Shanghai eine Methode der ultratiefen Phosphorylationsproteomik entwickelt, die eine umfassende Bewertung der Selektivität von PKI auf zellulärer und proteomischer Ebene ermöglicht.
Die Proteinphosphorylation ist sehr dynamisch und mit niedrigem Überfluss gekennzeichnet (das phosphorylierte Proteom macht nur 0,1% des gesamten Proteoms aus, während Tyrosinphosphoryliertes Protein nur 0,1-1% des phosphorylierten Proteoms ausmacht), so dass die Anreicherung der phosphorylierten Peptidensegmente ein entscheidender Schritt in der Massenspektralanalyse ist. Zur genauen Messung der Phosphorylation Ereignisse, die durch PKI verursacht werden, wurde auf der Grundlage einer von ihnen entwickelten Reihe von Micro-Holistic-Affinity-Column-Technologien (Anal Chem 2020, 92, 3913-3922, J Proteome Res 2023, 22, 2450-2459, Anal. Chem. 2023, 95, 8605-8612) eine Strategie vorgeschlagen, die drei selektiv komplementäre Phosphorylationspeptidsegment-Anreicherungsmaterialien integriert, um eine tiefe, vollständige Abdeckung und eine unvoreingenommene quantitative Analyse der Phosphorylationspeptidsegmente zu erreichen (Abbildung 1).
Abbildung 1. Ultra-Tiefe Phosphorylation Proteom Analyse Prozessdiagramm und Profil der Phosphorylation Proteom Analyse Daten (Klicken Sie, um das große Bild zu sehen)
Nach dem Modell von Zebutinib wurde in den Daten der Datenabhängigkeit Spektroskopie (DDA) eine signifikante Erhöhung der Phosphorylationswerte an 25 Phosphorylationsstellen von 25 Proteinen und eine signifikante Verringerung der Phosphorylationswerte an 72 Phosphorylationsstellen von 66 Proteinen festgestellt (wobei der Anteil der Tyrosinphosphorisation 80,9% betrug). In den Daten der Nicht-Abhängigkeit-Spektroskopie (DIA) wurde eine signifikante Erhöhung des Phosphorylationsniveaus an 91 Phosphorylationsstellen mit 80 Proteinen und eine signifikante Reduktion des Phosphorylationsniveaus an 167 Proteinen (überwiegend Serin / Surin-Phosphorylationsstellen) festgestellt (Abbildung 2).
Abbildung 2. Ultratiefe Phosphorylationsproteomik-Analyse zeigt Veränderungen der Phosphorylationsereignisse in B-Zellen-Lymphozyten, die durch Zebutinib verursacht werden (klicken, um eine größere Abbildung zu sehen)
Abbildung 3. Proteinkinasen, die von Zebutinib gehemmt oder aktiviert werden, und deren zelluläre Prozesse
(Klicken Sie auf das große Bild)
Die bioinformatische Anreicherungsanalyse zeigte, dass Neben der Hemmung der BCR- und FcR-Signalwege Zebutinib auch Signalwege wie B-Zell-Apoptose, EGFR, ERBB, RPTK und MAPK-Kaskade regulierte (Abbildung 3). Interessanterweise hat Zebutinib nicht nur BTK und mehrere wichtige Signalwege nachgeschaltet, sondern auch die Phosphorylation der RAF1-, CBL- und PTPN11-Proteine erhöht, was die ERK1/2 MAPK-vermittelte BCR-Signalwege mit negativer Rückkopplungsregulation aktiviert und die Signaltransferenz aufstream des BCR-Signalweges blockiert. Im Vergleich zu den in der Literatur berichteten Zebutinib-Zielen entwickelten sie eine ultra-tiefe Phosphorylationsproteomik-Strategie, die reichhaltigere Wirkungsziel- (oder Off-Target) -Informationen auf lebenden Zellenebene mit hohem Durchfluss erlangt. Durch die Abbildung von Phosphorylationsereignissen in den zellulären Signalwegen kann der Wirkungsmechanismus von Zebutinib panoramisch aufgedeckt werden (Abbildung 4).
Abbildung 4. Mögliche molekulare pharmakologische Mechanismen von Zebutinib durch eine ultratiefe Phosphorylationsproteomik (Klicken, um eine größere Abbildung zu sehen)
Zusammenfassend kann eine ultratiefe Phosphorylationsproteomik-Analyse nicht nur die Selektivität von Proteinkinase-Inhibitoren auf zellulärer Ebene mit hohem Durchfluss, hoher Empfindlichkeit und hoher Zuverlässigkeit umfassend bewerten, sondern auch durch die Analyse der durch Medikamente verursachten Phosphorylationskaskadenreaktionen einen feineren Wirkungsmechanismus von PKI aufdecken. Darüber hinaus kann diese Technik weit verbreitet in der Signaltransportforschung in der Zellbiologie verwendet werden. Der Doktorand Zhang von Shanghai Institute of Organic Chemistry der chinesischen Akademie der Wissenschaften ist der erste Autor der Dissertation, der Bio-Kang-Wu-Forscher des Shanghai Institute of Organic Chemistry der chinesischen Akademie der Wissenschaften und der Hao Pilian-Forscher der Plattform für die Omik-Analyse der Universität der Wissenschaft und Technologie von Shanghai sind Co-Autoren der Kommunikation. Vielen Dank für die Hilfe bei der Astral Analyse. Diese Arbeit wurde von Projekten und Fonds wie dem Nationalen Naturwissenschaftlichen Fonds, der chinesischen Akademie der Wissenschaften und dem Shanghai Municipal Science Committee finanziert.