Die Polymerisationschromatografie-Säulen haben die Vorteile eines breiten Säure-Alkali-Bereichs, einer hohen chemischen Stabilität, einer hohen mechanischen Festigkeit und der Komplexität der anwendbaren Substrate, die eine wichtige Position in den Anwendungsbereichen der Flüssigchromatografie (HPLC) wie der Lebensmittelanalyse, der Umweltüberwachung und der Forschung und Entwicklung von Arzneimitteln einnehmen. Mit zunehmender Verwendung werden Schadstoffe in der Probe (z. B. Proteine, Lipide, starke Retentionsorganische Stoffe usw.) jedoch allmählich an die Oberfläche der chromatischen Säulenfüllstoff oder verstopfte Öffnungen adsorbiert, was zu einer verringerten Säulenwirkung, einer verringerten Trennung und anderen Problemen führt. Im Vergleich zum direkten Ersatz einer neuen Chromatografie-Säule kann eine wissenschaftliche Regenerationsbehandlung die Säulenleistung effektiv wiederherstellen, die Lebensdauer verlängern und die Analysekosten senken. Dieses System kämmt die Verschmutzungstypen der Polymerisationschromatografie-Säulen, erläutert gezielte Regenerationsmethoden und Betriebspunkte und bietet technische Anleitung für die Normierung des Laborbetriebs.
I. Kernprinzipien und Vorbereitung der Polymerisationschromatografie
Der Kern der Recyclingbehandlung besteht darin, die Verunreinigungen durch die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittelsystems zu beseitigen und gleichzeitig die Integrität des Säulenbettes zu schützen, ohne die Polymerfüllstoffstruktur zu zerstören (z. B. Vernetzungsbruch, Aperturverformung zu vermeiden). Vor der Durchführung der Regeneration müssen drei Schlüsselbereitungsarbeiten abgeschlossen werden: Erstens ist es, die Art der Verschmutzung zu bestimmen, die Eigenschaften der Schadstoffe in Verbindung mit der Probenmatrix zu spekulieren, zum Beispiel biologische Proben, die häufig proteinähnliche Schadstoffe enthalten, können Umweltproben starke polare organische Substanzen zurückbleiben; Zweitens ist die Sammlung von grundlegenden Informationen zur Chromatografie-Säule, die Anleitung zur Bestätigung des Füllstoffmaterials (wie Polystyren-Divinylbenzen, Polymethylacrylat usw.), des Lösungsmittelbereichs und des Druckstandes (in der Regel ist die Polymersäule unter dem Druck der Silikonsäule verträglich, in der Regel nicht mehr als 20 MPa); Drittens ist die Durchführung der Basis-Test der Säulenleistung, durch die Bestimmung der Anzahl der theoretischen Türmplatten, der Trennungsgrad und der Symmetriefaktor der Standardprobe (z. B. der Benzinmischprobe), um die Leistung vor und nach der Regeneration zu vergleichen.
Zielgerichtete Regenerationsmethoden basierend auf der Art der Verschmutzung
Die Verschmutzung der polymerisierten Chromatografie-Säulen kann in reversible Adsorption-Verschmutzung und irreversible Ablagerung-Verschmutzung unterteilt werden, die Waschstrategie nach dem Mechanismus der Wechselwirkung von Schadstoffen und Füllstoffen ausgewählt werden muss. Die häufig verwendeten Regenerationsmethoden umfassen die Gradiententwaschmethode, die spezifische Lösungsmittelwaschmethode und die kombinierte Regenerationsmethode.
(a) Konventionelle reversible Adsorption Verschmutzung Gradient Waschen und Regenerieren
Für Schadstoffe mit schwacher bis mittlerer Retentionsstärke in der Probe (z. B. die meisten kleinen molekularen organischen Stoffe und einige polare Verunreinigungen) kann eine Gradientwäsche verwendet werden, um die Lösemittelwäschestärke schrittweise zu erhöhen und die Schadstoffentbindung zu erreichen. Diese Methode ist für die routinemäßige Wartung von täglichen leichten Verschmutzungen geeignet, wobei die spezifischen Betriebsschritte wie folgt sind: Spülen Sie zunächst ein Volumen von 10 Säulen (CV) der Chromatografie-Säule mit einer niedrigen Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml / min mit einer ersten Flussphase (z. B. Methanol-Wasser-System) und entfernen Sie die Restproben in der Säule; Anschließend erhöhen Sie das Verhältnis von starken Waschlösungsmitteln nach einem proportionalen Gradienten, wie z. B. den schrittweisen Übergang von Methanol-Wasser (50: 50, v / v) zu reinem Methanol (100%), die Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 mL / min aufrechterhalten und 15-20 CV spülen; Wenn ein umgekehrtes Chromatografiemodus verwendet wird und die Schadstoffe polare Komponenten enthalten, können Sie weitere 10 CV mit Methanol-Acenitril (50: 50, v / v) spülen, um die Entfernungswirkung von nicht-polaren Schadstoffen zu verbessern; Schließlich ausgeglichen 10-15CV mit der ersten Flussphase, bis die Basislinie stabil ist. Diese Methode beschädigt den Polymerfüllstoff wenig, und die Recycling-Säulen-Wiederherstellungsrate kann in der Regel über 85% erreichen.
(2) Spezifische Lösungsmittelregeneration, die starke organische Verschmutzung behält
Wenn die Probe polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, langkettige Fettsäuren und andere stark gehaltene organische Stoffe enthält, ist die konventionelle Gradientwäsche schwer zu entfernen und muss ein spezifisches Lösungsmittelsystem verwendet werden, um die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Schadstoffen und Füllstoffen zu zerstören. Für Polystyren-Divinylbenzen (PS-DVB) Polymerisationssäulen wird die dreistufige Entfernungsmethode "Methanol-Tetrahydrofuran-Methanol" empfohlen: Spülen Sie zuerst 10CV mit reinem Methanol, um die Oberflächenreste zu entfernen, dann mit Tetrahydrofuran (THF) als starkes Entfernungsmittel, spülen Sie 20-30CV mit einer niedrigen Geschwindigkeit von 0,3 mL / min und nutzen Sie die hohe Löslichkeit von THF, um die hydrophoben adsorbierten Schadstoffe zu entfernen; Da THF eine leichte Inflationswirkung auf Polymerfüllstoffe hat, muss man anschließend 15CV mit reinem Methanol rückwärts spülen, die Füllstofföffnung schrittweise zusammenziehen und den Rest von THF abwaschen; Schließlich mit der ursprünglichen Strömung ausgeglichen. Wenn Schadstoffe starke polare Substanzen (wie Aminoverbindungen) sind, können 0,1% (TFA) im Waschsystem hinzugefügt werden, um die polare Wechselwirkung durch die Einstellung des pH-Wertes zu schwächen, aber beachten Sie, dass die TFA-Konzentration nicht mehr als 0,5% betragen sollte, und nach der Regeneration 0,05% Ammoniak enthaltende Methanollösung und 5CV zu spülen, um saure Restkorrosionssäulenbett zu vermeiden.
(3) Enzymolyse-Lösungsmittelkomplexe Regeneration von Biomolekularen
Nach der Analyse von Bioproben (z. B. Serum, Urin, Pflanzenextrakte) werden Biomoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und andere leicht durch Hydrophobie oder Wasserstoffbindungen fest an die polymerisierte Füllstoffoberfläche adsorbiert und sogar gelförmige Ablagerungen gebildet. Zu diesem Zeitpunkt ist eine kombinierte Regenerationsstrategie der "Enzymalyse-Vorbehandlung + Lösemittel-Waschung" erforderlich: Zuerst eine Pufferlösung mit Protease (wie Panprotease, Konzentration 0,1 mg / ml) (pH 7,0 Phosphatpuffer) zusammenzubereiten, Spülen Sie die Chromatografie-Säule 30CV mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,2 mL / min und lassen Sie sie 2 Stunden unter konstanten Temperaturbedingungen bei 37 ° C stehen, damit das Enzym die proteinähnlichen Schadstoffe vollständig abbaut; Spülen Sie anschließend 10CV mit einer 5%-igen Methanol-Wasserlösung, um die Restenzymlösung zu entfernen, und waschen Sie sie dann nach dem Gradienten der Reihenfolge "Wasser-Methanol-Acenitril-Methanol" ab, spülen Sie 15CV pro Lösungsmittelphase mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml / min; Spülen Sie schließlich 5CV mit einer Methanol-Lösung, die 0,01% Natriumstickstoff enthält (die Reproduktion von Mikroben hemmt) und speichern Sie mit reinem Methanol. Die Methode zur Regeneration von biologischen SchadstoffsäulenDie theoretische Anzahl der Türme kann auf mehr als 80 Prozent der neuen Säulen zurückkehren.
(4) Spülregeneration von Salz- und Partikelverschmutzung
Wenn die Flussphase Puffersalze enthält (z. B. Phosphate, Ammoniumsätt) oder die Probe suspendierte Partikel enthält, können Salzkristalle oder Partikelabscheidungen am Säuleneingang leicht entstehen, was zu einem ungewöhnlich hohen Säulendruck führt. Der regenerative Schwerpunkt dieser Verschmutzung ist "Low-Intensity-Lösung + physikalisches Spülen": zuerst wird die Chromatografie-Säule umgekehrt angeschlossen (um Schadstoffe in die Tiefe des Säulenbettes zu vermeiden), 20CV mit ultrareinem Wasser mit einer niedrigen Geschwindigkeit von 0,3 mL / min gespült, um die Salzkristallisation zu lösen; Wenn der Säulendruck noch hoch ist, kann man 15CV mit einer 5%-igen Methanol-Wasserlösung spülen, um die schwache Entfernungsfähigkeit des Methanols zu nutzen, um die Entfernung von Partikeln zu unterstützen; Bei hartnäckigen Partikeln können drei Zyklen abwechselnd mit "Wasser-Methanol-Wasser" gespült werden, um die Ablagerungen durch die durch die Veränderung der Lösungsmittelviskosität erzeugte Scherkraft zu entfernen. Beachten Sie, dass der Druck beim Spülen die Chromatografie-Säule nicht überschreiten darf.80% des Drucks tolerieren und nach der Regeneration eine positive Verbindung erfordern, die mit der ursprünglichen Strömungsphase bis zur Basisstabilität ausgeglichen wird.
Wichtige Vorsichtspunkte und Wirkungsbewertung bei Regenerationsvorgängen
Die Betriebsnormen im Regenerationsprozess haben direkten Einfluss auf die Wiederherstellungseffekte und die Lebensdauer der Säulen, die vier Prinzipien streng befolgen müssen: Erstens ist die Kontrolle der Durchflussgeschwindigkeit und des Drucks, der gesamte Start mit einer niedrigen Durchflussgeschwindigkeit (0,3-0,8 mL / min), um plötzliche Druckanstiege zu vermeiden, die zum Zusammenbruch des Säulenbettes führen, und der Druckspitze überschreitet nicht die Obergrenze der Anleitung; Zweitens ist es, die Lösungsmittelmutation zu vermeiden, während verschiedene Lösungsmittelwechsel einen Gradientenübergang anwenden muss (z. B. beim Wechsel von Methanol nach THF, das Verhältnis nach und nach mit einem Gradienten von 10% anzupassen), um zu verhindern, dass die polare Mutation des Lösungsmittels ungleichmäßige Aufblasung des Füllstoffs verursacht; Drittens ist es, kontraindizierte Lösungsmittel wie Polymethylacrylat-Polymer-Kolonnen mit Chlorform, Dichlormethan und anderen halogenen Kohlenwasserstofflösungsmitteln zu verbieten, und PS-DVB-Kolonnen vermeiden langfristigen Kontakt mit starken alkalischen Lösungsmitteln (pH > 12); Viertens ist der Schutz der Lagerung nach der Regeneration, kurzfristig nicht mit reinem Methanol oder Essignitril gespeichert, langfristige Lagerung muss regelmäßig das gespeicherte Lösungsmittel ersetzen (alle 3 Monate).
Die Beurteilung der Regenerationswirkung muss durch drei Kernindikatoren überprüft werden: die Anzahl der theoretischen Platten (effektiv gegenüber einer Erhöhung von mehr als 50% vor der Regeneration), die Trennungsgrade (die benachbarte Spitzensetrennung wird auf mehr als 1,5 wiederhergestellt) und die relative Standardabweichung der Retentionszeit (RSD < 2%). Wenn die Standardprobe nach mehreren Regenerationen immer noch unter 1,0 getrennt ist oder der Kolonnendruck weiter über 50% der neuen Kolonnen ansteigt, zeigt dies, dass die Chromatografie-Kolonnen nicht effektiv regeneriert werden können und eine neue Kolonnen ersetzt werden müssen.
4. Schlussfolgerung
Die Regenerationswirkung einer Polymerisationschromatografie-Säule hängt von der Genauigkeit der Beurteilung der Art der Verschmutzung und der Eignung der Regenerationsmethode ab. Im täglichen Gebrauch sollte ein Managementmodell der "Vorbeugung vorrangig, stufenweise Regeneration" eingerichtet werden: durch die Vorbehandlung der Probe (z. B. Filtration, Extraktion) reduzieren Sie die Einbringung von Schadstoffen und führen Sie regelmäßig eine leichte Gradientreinigung durch; Präzise Auswahl von Regenerationsstrategien wie Enzymolysen und spezifische Lösungsmittel für verschiedene Verschmutzungstypen und strikte Kontrolle der Betriebsparameter. Die wissenschaftliche Recyclingverarbeitung kann nicht nur die Laborverbrauchskosten erheblich senken, sondern auch die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Analysedaten durch die Aufrechterhaltung der Stabilität der Säulenleistung gewährleisten und die effiziente Durchführung der Flüssigchromatographie unterstützen.