Für die Genübertragung schwer transfizierter Zellen haben Wissenschaftler der National University of Singapore ein chimerisches Genübertragungssystem mit der Microcellular Vescillar Technology (mCVT) entwickelt, die einen Liposomen-Extruder von Genizer in den USA nutzte und die Ergebnisse in der Zeitschrift Nanoscale veröffentlichte. Der vollständige Titel lautet: Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

In dieser Studie stellte das Forscherteam der National University of Singapore ein neues System für die chimerische Genlieferung vor, das auf der Micro Cell Vesicle Technology (mCVT) basiert. Dieses Gen-Delivery-Plattform-System, das aus der Fusion von Zellmembranen und cationischen Lipiden besteht, wird verwendet, um die Transfektionseffizienz von schwer zu transfektierenden HTT-Zellen zu verbessern. Die Zellmembranbestandstoffe der Mikrozellvesikeln verleihen dem gesamten Komplex Zytotonik-Spezifizität und reduzieren die Komplex-Zytotoxizität während der Transfektion, während cationische Lipide für die Bindung an genetisches Material verantwortlich sind und gleichzeitig mCVTs strukturelle Integrität bieten.

Hintergrund

Die Genübertragung ist der Prozess, bei dem fremde DNA in die Eukariozellen eingeführt wird. Zum Beispiel die Übertragung therapeutischer oder funktioneller Gene zur Änderung von Zellprozessen in Grundlagenforschungen (z. B. Medikamentenentdeckung und Mechanismenforschung funktionaler Proteine) und in klinischen Anwendungen (z. B. Gentherapie). Eine effektive Gentransfektion erfordert nicht nur die erfolgreiche Einführung fremder Nukleensäuren in die Zelle, sondern auch ihren späteren Transport und Expression in der Zelle. Dies ist eine anspruchsvolle Aufgabe, da die DNA-Moleküle selbst negativ geladen sind und daher in ihrer konventionellen Form schwer von den Zellen internalisiert werden können. Daher ist ein großes Interesse an der Entwicklung effektiver Genübertragungssysteme entstanden. In den letzten Jahrzehnten wurden eine Vielzahl von Trägersystemen erforscht, von virusbasierten Liefersystemen bis hin zu nicht-virusbasierten Trägern. Trotz der relativ niedrigen Transfektionseffizienz von nicht-viralen Genlieferträgern wird erwartet, dass sie in Bezug auf Sicherheit und klinische Akzeptanz aussehen, wobei cationische Lipidsysteme und polymerbasierte Plattformen die wichtigsten Beispiele sind. Tabelle 1 fasst die wichtigsten Vorteile und Nachteile der derzeit häufig verwendeten Transfektionsmittel oder -methoden zusammen.

Ein ideales nicht-virales Gen-Delivery-System sollte in der Lage sein, die benötigten DNA-Moleküle effektiv in bestimmte Zelltypen mit minimaler Zytotoxizität zu liefern, um die maximale Expression des Zielgens zu gewährleisten. Wir wissen jedoch, dass die derzeit auf dem Markt erhältlichen Transfektionsreagenzien diese Kriterien offensichtlich nicht erfüllen, insbesondere wenn sie für die Transfektion schwer transfizierbarer Zellen (HTT) verwendet werden.

HTT-Zellen umfassen in der Regel Primärzellen, embryonale Stammzellen und einige lebendige Zelllinien wie 3T3-L1 (Pre-Maus-Fettzellen), U937 (menschliche Mononukleozellen), Jurkat (menschliche T-Lymphozyten), HUVEC (menschliche Nabelvenen Endothelizyten) usw. Statistisch gesehen ist die Effizienz der Plasmidtransfektion von HTT-Zellen mit handelsüblichen Reagentien oft nicht mehr als 25%. Einer der Gründe für die geringe Absorption von Fremdstoffen und Plasmiden durch HTT-Zellen ist ihre geringe metabolische Aktivität. Darüber hinaus sind diese Zellen in der Regel sehr empfindlich auf Zellstörungen, die durch das verwendete Transfektionsreagens verursacht werden, was zu Zytotoxizität führen kann und schließlich zum Zelltod führt.

In letzter Zeit hat sich aufmerksam gemacht, da ein Delivery-System von zellulärer Quelle das Potenzial hat, aktive Lademolekule bis zu einem gewissen Grad spezifisch an die Zielstelle zu liefern. Tatsächlich haben viele Studien die Verwendung von mononukleozytischen Drogenlieferungssystemen (DDS) zur gezielten Lieferung von Chemotherapie-Medikamenten und Plasmid-DNA (pDNA) an den Tumor oder die Verwendung von DDS aus roten Blutkörperchen zur Verlängerung der Blutzirkulation und zur gezielten Lieferung von pDNA an die Blutzellen untersucht. Es wird vermutet, dass die Aufrechterhaltung der Zellmembranbestandteile der Mutterzellen diesen zellbasierten Drogenlieferungssystemen die Fähigkeit geben wird, bestimmte Zielzellen zu erkennen, was möglicherweise durch die Vermeidung der Erkennungsfähigkeit des Immunsystems des Körpers erleichtert wird.

Trotz seiner bedeutenden therapeutischen Bedeutung ist das volle Potenzial von zellbasiertem DDS bei der Genübertragung bisher weitgehend ungenutzt. Zu den wichtigsten Herausforderungen, die zu lösen sind, gehören die mühsamen und niedrigen Durchfluss-Isolierungs- / Produktionsprozesse von zellulären DDS (z. B. exosomale Formen) sowie die suboptimalen Gen-Ladung- / Composite-Technologien. Obwohl diese Systeme daher in Bezug auf ihre intrinsische Zielgebung sehr vorteilhaft erscheinen, haben sie erhebliche Einschränkungen in Bezug auf die Leistung und die Effizienz der pDNA-Ladung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, schlagen wir hier vor, ein neues chimerisches Gen-Delivery-System zu entwickeln, das aus Zellmembranbestandteilen und cationischen Lipidbestandteilen besteht, die erstere zur Verbesserung der Internalisierung von Zielzellen und letztere zur Verbesserung der Belastung von pDNA verwendet werden.

In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung der Mikrozellvesikeltechnologie (mCVTs), einer neuen Mischförderplattform, die durch die Fusion von cationischen Lipiden mit der Zellmembran erzielt wird. Zur Herstellung von mCVTs werden die Zellen zunächst mit einer niedrigen Perforationslösung behandelt, um Geisterschattenzellen (CG ohne Zytoplasm in Organzellen) zu erhalten, wie Goh et al. beschrieben haben. Die Low-osmose-Lösung bildet eine kurze Öffnung auf der Plasma, die es erlaubt, den Inhalt in der Zelle zu entfernen und gleichzeitig die Integrität der Plasma zu erhalten. CG aus verschiedenen Zellen, die in einem wasserlichen Medium suspendiert wurden, wurde verwendet, um den getrockneten DOTAP-Lipidfilm zu hydratisieren, der anschließend durch einen Liposomen-Extruder extrudiert wurde, um mCVTs mit einer durchschnittlichen flüssigkeitsmechanischen Größe und Zeta-Potenzial zu liefern, die ähnlich sind wie die extrudierten DOTAP-Liposomen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass mCVTs in der Lage sind, sich mit Plasmoiden zu verbinden und von Zielzellen zu internalisieren, mit minimaler Zytotoxizität. Interessanterweise zeigten mCVTs, die aus verschiedenen Zelltypen in vitro verglichen wurden, eine deutlich höhere Transfektionseffizienz für die Zelltypen, die von mCVTs stammen.

Methoden und Ergebnisse

Vorbereitung von Ghost-Shadow-Zellen (CG ohne Zytoplasma und Organ-Zellmembrane), um die Wiederholbarkeit und Sicherheit von mCVTs zu gewährleisten.

Methoden und Ergebnisse kurz

Produktion und Charakterisation von mCVTs.

Ähnlich wie bei der Liposomenproduktion wird die Lipid-Filmmethode zur Herstellung von mCVTs verwendet. Die DOTAP-Folie wird mit CG hydratiert und bildet ein großes polymolekulares Lipidsom, das CG umhüllt. Diese Suspension wurde extrudiert und die Plasmamembran aus CG enthielt das DOTAP-Lipid (wie in Abbildung 3A gezeigt). Nach der zuvor von unserem Team etablierten Methode wurde gezeigt, dass die so erzeugten mCVTs nach der Extrusion aus der Fusion von Lipiden und CG-Membranen bestehen. Im Allgemeinen ist die Größenverteilung von mCVT ähnlich wie Liposomen. Um die Robustheit und Vielseitigkeit dieses Ansatzes in verschiedenen Zelllinien zu demonstrieren, wurden mCVTs mit CG aus verschiedenen Zelllinien hergestellt, wie einige HTT-Zellen (dh 3T3-L1) und Nicht-Krebszellen (dh HEK293 und RAW264.7). Wie in Abbildung 3B gezeigt, liegen die fluidmechanischen Größen und PDI verschiedener mCVTs in der Regel im Bereich von 400 nm (PDI ~ 0,4), ähnlich wie DOTAP-Liposome (PDI ~ 0,2), die mit der gleichen Extrusionsmethode hergestellt werden. In Abbildung 3C wurden ähnliche zeta-Potentialwerte (etwa +30 mV bis +40 mV) in verschiedenen Rezepturen beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Methode allgemein für CG verwendet wird, die aus verschiedenen Zelllinien erzeugt wird. Interessanterweise ist, dass mCVT3T3-L1, wenn es sich mit pDNA repliziert, eine ähnliche Größenverteilung wie nicht replizierte mCVTs hat, während das Gesamtzeta-Potential negativ wird, was auf einen erfolgreichen Replikationssignal hindeuten kann (da die negativ geladene pDNA positiv geladene mCVTs neutralisiert).

A. Schema von mCVTs, die die Fusion von Liposomen aus zellulären Geister und Hydrierungsfilm umfasst.

B. Verschiedene hydrodynamische Größen von mCVTs und mCVT3T3-L1 mit Plasmiden im Vergleich zu DOTAP-Liposomen. Alle mCVTs sind kleiner als 500 Nanometer groß.

C. Zeta-Potenzial von mCVTs und mCVT3T3-L1 mit Plasmoden im Vergleich zu DOTAP-Liposomen. Alle mCVTs hatten ein Zeta-Potenzial über +30 mV, mit Ausnahme von mCVT3T3-L1 mit Plasmid-DNA (5 µg), das aufgrund der Wechselwirkung mit Plasmid-DNA ein negatives Zeta-Potenzial zeigte. Die Daten repräsentieren den Durchschnittswert ± SD (n = 3).