Zusammenfassung: Die Glukoseopfuhr von Bacillus glutamatus erfolgt hauptsächlich durch das Glycosyrophosphorsäuretansferase-System (PTS) mit hoher Glukoseaffinität (Km = 0,35 mM). Die Auswahl von Mutanten, die 2-Deoxyglukose (2DG) und keine PEP-abhängige Glukosetransportaktivität tolerieren können, die in einem Medium wachsen können, in dem Glukose als einzige Kohlenstoffquelle und Energiequelle verwendet wird, reduziert die Zuckeraufnahme deutlich durch ein Nicht-PTS-Aufnahmesystem mit niedriger Affinität (Ks = 11 mM). In Medien mit unterschiedlichem Penetrationsdruck wächst, wilde Typ-Zellen sind weniger als die Glukoseverbrauchsrate und weniger als die Wachstumsrate. Die Zellen dieser Kulturen zeigten eine ähnliche PTS-Aktivität, wenn sie unter Standardbedingungen gemessen wurden. Wenn die Zellen jedoch wieder in einem Puffer mit unterschiedlichem Penetrationsdruck suspendiert wurden, zeigte sich die PTS-Aktivität in Verbindung mit dem Penetrationsdruck. Dieser hemmende Effekt kann den Rückgang der Zuckerabsorption und der Wachstumsrate erklären, die in einem hohen Penetrationsdruck-Fermentationsmedium beobachtet wurde. Nicht-PTS-Glukosetransportsysteme sind jedoch nicht vom Mediumpenetrationsdruck beeinflusst. Eine ähnliche Unterdrückung der Zuckertransportfähigkeit wurde unter industriellen Produktionsbedingungen beobachtet, da der Penetrationsdruck des Glutasäurekakumulationsmediums entsprechend erhöht wurde. Das Phänomen beschränkt somit den Fermentierungsprozess, da eine Verringerung der Verhältnisrate zu einem erhöhten Zuckeranteil führt, der für die Aufrechterhaltung der Zelle verbraucht wird, gleichzeitig mit einer Verringerung der Produktproduktivität.

Schlüsselwörter: Glukosetransport; Penetrationsdruck; Glutasäure Fermentation; Bacillus glutamatus;

Forschung:

Auswirkungen des Penetrationsdrucks auf die Vitalität des PTS-Glukosenaufnahmesystems

Die PTS-Aktivität bleibt konstant unter einem Penetrationsdruck von 800 mOsmol/kg, danach sinkt die PTS-Aktivität linear mit steigendem Penetrationsdruck. Bei einem Penetrationsdruck von 1900 mOsmol/kg ist die PTS-Aktivität nur 15% auf dem höchsten.

2. Auswirkungen des Penetrationsdrucks auf die Glutasäurefermentation

Die Ansammlung von Glutasäure und Submetaboliten führt zu einer signifikanten Erhöhung des Mediumpetraktionsdrucks, der durch die Zugabe von Alkalien (in diesem Fall Ammoniak) weiter verschärft wird, um den pH-Wert konstant zu halten. Dieses Phänomen wurde bei dem temperaturempfindlichen Stamm 2262 beobachtet, der eine hohe Produktkonzentration (Glutasäure > 85 g/L) erreichen kann und einen Penetrationsdruck von über 2000 mOsmol·kg-1 erreicht. Der Zuckerverbrauch bleibt in den ersten Stunden unverändert und

allmählich abnehmen. Um zu überprüfen, ob eine Schwächung der Aktivität mit einer erhöhten Penetrationsdruckerhöhung durch Glutasäurekumulation verbunden ist, wurde der Beitrag der PTS-Aktivität zur Gesamtzuckeraufnahme gemessen, der in der wilden Bakterie Bacillus glutamatus ATCC17965 gemessen wurde, nämlich 4,5 mmol.g-1 · h-1. Bei den Glutasäureproduktionsstämmen ist die Gesamtzuckeraufnahme schneller, was auf eine höhere Penetransaktivität hindeutet. Die gemessenen Glukoseopfuhrraten unter nicht-Zwangsbedingungen zeigen, dass das Penetranzym in Bacillus glutamatus 2262 bis zu 25% der gesamten Glukoseopfuhr beiträgt. Bei der Messung der inhibierenden Auswirkungen des Penetrationsstresses auf die PTS-Aktivität nach in vitro-Messmethoden des PTS-Transportsystems (der Beitrag des Penetranzems ist vernachlässigbar) kann ein Rückgang des Glukoseverbrauchs sehr nahe an den prognostizierten Rückgang der PTS-Aktivität gesehen werden (Abbildung 3a). Bei der Anwendung einer Glukose-Ergänzungsstrategie, die eine hohe Konzentration aufrechterhalt (50 g · l-1), kann eine Verbesserung des Glukoseverbrauchs auf die hohe Sättigung des Systems durch die Penetranzeaktivität und die Glukose im Reaktor zurückzuführen sein (Abbildung 3b).

3. Auswirkungen auf die Produktivität von Glutasäure

Sobald der Penetrationsdruck im Medium erhöht ist, ist eine der Folgen einer Abnahme der metabolischen Aktivität eine signifikante Verringerung der Glutasäureerzeugung am Ende der Fermentation. Der Rückgang des Glukoseverbrauchs führt zu einer Abnahme der Glutaseerzeugung, die aufgrund eines erhöhten Anteils an Glukose verursacht wird, die in CO2 umgewandelt wird. Die CO2-Produktion bleibt während der gesamten Produktionsphase im Wesentlichen konstant, was darauf hindeutet, dass die biochemische Energie, die aus dem Zuckerabbau gewonnen wird, um den Bedarf an Zellünterhalt zu decken, konstant ist, der proportional zur Biomasse im Fermentationsbehälter ist.

Die Verringerung des Zuckerverbrauchs erfordert daher eine Erhöhung des Zuckeranteils. Bei der Berechnung mit einem Aufrechterhaltungskoeffizienten von 0,6 mmol Glukose / g Zellen / h für Bacillus glutamata, erhöht sich der Anteil der Glukose, die für die Aufrechterhaltung der Zellen benötigt wird, von 15% des Gesamtzuckerverbrauchs in der ersten Phase der Glutasäureproduktion auf 40% bei der höchsten Fermentationsphase-Penetrationsdruck (Abbildung 4). Die in der späten Fermentationsphase beobachteten Rückgänge der Glutasäureentwicklung sind im Einklang mit Veränderungen des Kohlenstoffmetabolischen Stroms, der die Nachfrage aufrechterhalten. Abhängig von einer Verringerung des metabolischen Sauerstoffbedarfs während der Abwächung der metabolischen Aktivität kann die Kontrolle der Restzuckerkonzentration aufgrund von Sauerstoffveränderungen einen teilweisen Ertragsverlust wiederherstellen.

4. Diskussion

In diesem Artikel wird erläutert, dass die Suppression der späten Glutasäurefermentation direkt mit den kontrollierten Auswirkungen der Produktakkumulation und der Penetration der Umgebung auf die Zuckerabsorptionsfähigkeit verbunden ist. Dieses Phänomen ist nicht auf eine Änderung des Niveaus der Genexpression zurückzuführen, sondern auf eine Änderung der biochemischen Aktivität des Transportsystems unter Bedingungen der Penetrationszwang. Darüber hinaus ist dieser Effekt reversibel, da die gewaschen Zellen ihre Fähigkeit, Zucker zu transportieren, wiederherstellen können, sobald der Penetrationszwang beseitigt ist. In ähnlicher Weise ist die Fähigkeit des normalen Wachstums von Zellzuckertransportern auch signifikant vermindert, wenn sie in einem hoch osmetrischen Puffer wiedersuspendiert wird. Mit zunehmendem Penetrationsdruck führt dieser physiologische Effekt zu einer Abnahme der Zuckerverbrauchsfähigkeit und einer Verlangsamung der Stoffwechselrate. Da der Energiebedarf zur Erhaltung der Biomasse unverändert bleibt und in vielen Fällen zusätzliche Energie benötigt wird, um diesen Druck zu bewältigen, wird dies auch zu einer geringeren Produktproduktivität führen. Der zunehmende Zuckerverbrauch wird für die Energieproduktion verwendet und wird daher in Form von Kohlendioxid auf Kosten der Produktreduzierung verloren gehen. Bei der Glutasäurefermentation verringern sich sowohl der Ertrag als auch die Ausbeute erheblich, wenn der Mediumpenetrationsdruck steigt. Der biochemische Mechanismus, der eine Abnahme der PTS-Proteintansportkapazität auslöst, muss noch festgestellt werden, kann jedoch mit strukturellen Veränderungen des Protein-/Membrankomplexes verbunden sein. Stämme, die Glutasäure effizienter oder schneller produzieren, werden die Penetrationsschwelle schneller erreichen, was zu einer möglichen Ertragssteigerung nach 24 Stunden der Fermentation führt. Daher ist das Screening von Stämmen mit hoher Druckbeständigkeit von Vorteil für die Fermentation, um sicherzustellen, dass industrielle Stämme robust genug sind, um eine hohe Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, wenn eine hohe Produktleistung erzielt wird. Ein weiterer Weg, um diese Stoffwechselsperrung zu überwinden, besteht darin, ein Fermentationssystem zu entwickeln, das den nachgelagerten Extraktionsprozess integrieren kann, um das Produkt bei der Fermentationsakumulation zu entfernen.